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多能干细胞(ES/iPS)冻存和复苏方法
2019.05.05   点击212次

多能干细胞(ES/iPS)冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环,但是多能干细胞不同于普通细胞系,其增殖扩增过程?#34892;?#35201;聚团生长,为保?#21046;?#32454;胞活性,不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法,不能很好的保持细胞活性,且复苏细胞成活?#24335;系汀?#26412;文就重点介绍多能干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。

介绍使用AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞,

本方法适用于AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞(同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞),冻存以及复苏前后,应当使用同一种培养基,复苏传代后可以更换其他培养体系。

erum-Free干细胞冻存液(AC-1001011/12)是埃泽思生物专为ES/iPS  细胞设计的的一款化学成分确定,无血清,无动物源成分,且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下:

1、冻存:以下操作方法以6?#35013;?#20026;例:

(1) Serum-Free干细胞冻存液为即拿即用,且4℃保存,冻存?#32791;?#20986;后应快速放回4℃;

(2)使用多能干细胞消化液(AC-1001008)消化细胞;

(3)收集细胞,室温300×g离心5分钟;

(4)小心吸掉上清液,不要干扰细胞团;

(5)用1ml冻存液重悬细胞,并均匀分装到冻存管中

采用非程序降温法,将冻存管直接放入-80℃冰箱中,冻存24h后转移至液氮中长期保存。

2、解冻

预先包被细胞培养板,人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

(1)多能干细胞培养基/Advance 多能干细胞培养基室温?#33014;?5-30min,不能37℃加热;

(2)在水浴锅中?#20013;?#26179;动冻存管,37℃水浴锅中快速解冻细胞,直至细胞完全融化;

(3)取出冻存管,用70%乙醇擦拭冻存管表面;

(4)准备15mL离心管,预先加入5mL多能干细胞培养基,将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中,尽量保持细胞聚团状态。

(5)在室温300×g离心5分钟。

(6)吸掉上清,注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次,不要破坏细胞聚团状态。

(7)?#30452;?#21462;0.5mL细胞悬液,均匀接种到包被好的6?#35013;?#30340;2个?#23383;校?#24182;?#30452;?#34917;充多能干细胞培养基至2m。

(8)置于37°C细胞培养箱中。在前后左?#39029;适?#23383;?#25105;?#21160;培养板板5次,以均匀分散细胞。

(9)每天更换培养基,并显微镜下观察细胞状。 

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